RESEARCHES REGARDING THE ULTRASTRUCTURAL MODIFICATIONS OF SPERMS CELLS BEFORE AND AFTER FREEZING IN DIFFERENT MEDIA
Stela Zamfirescu, Andreea Anghel
Abstract
Sperm cryopreservation is a method of ex situ preservation of gametes in all domestic animals, which is extensively used in artificial insemination. Factors that depend on the success of freezing sperm and hence obtain the product live are very numerous. Seminal plasma composition, extenders used for dilution, cryoprotectant concentration, reactive oxygen species, and not finally, cooling rate, influence the quality of sperm cells frozen and thawed and viable product number obtained after insemination of cryopreserved sperm. Research for recent years confirms that in sheep and goat fertility outcome is still very variable, regardless of conditions and environments of freezing-thawing used. Research shows that, regardless of solvent used, motility and membrane integrity of sperm deteriorates during cooling and storage at low temperature. These degenerative changes may be the result of lipid peroxidation and excessive production of reactive oxygen species (ROS). Our study presents the results of changes in the integrity of Saanen goat cell sperm membranes after freezing-thawing, after with Tris base extender enriched with 10mm L-cysteine (Sigma), 5 mg/ml BSA (Sigma) and 1mm vitamin E (DL-a-Tocopherol, Merck). After thawing, the biggest motility was obtained in vitamin E and cysteine variants (between 51-55%). Goat semen samples diluted with the 3 antioxidants were processed for examination and analyzed in terms of electron microscopic cellular integrity at all levels (head, mid piece, principal piece and endpiece). Electron photography analysis (X10.000) shows that full membrane were observed in a proportion of 49% of cells diluted with Tris-vitamin E at all levels of the cell, and at a rate of 37% in sperm cells diluted with Tris-cysteine. Swollen membranes, but continuous, were considered to be normal. The cell sperm diluted with medium supplemented with BSA present protein deposits with acicular aspect and membrane which presents small and frequent interruptions. Future research aim in vivo testing of goat sperm cryopreserved with different antioxidants to determine its fecundity.
CERCETĂRI PRIVIND MODIFICĂRILE ULTRASTRUCTURALE ALE CELULELOR SPERMATICE ÎNAINTE ŞI DUPĂ CONGELARE ÎN MEDII DIFERITE
Stela Zamfirescu, Andreea Anghel
Rezumat
Crioconservarea spermei este o metodă de conservare "ex situ" a gameţilor la toate animalele domestice, folosită extensiv la însămânţările artificiale. Factorii de care depinde succesul congelării spermei si, implicit, obţinerea de produşi vii, sunt foarte numeroşi. Compoziţia plasmei seminale, mediile utilizate la diluţie, concentraţia de crioprotectori, speciile reactive ale oxigenului, si nu in cele din urma, rata de răcire, influenţează calitatea celulelor spermatice congelate si decongelate si numărul de produşi viabili obţinuţi după inseminarea spermei congelate. Rezultatul cercetărilor din ultimii ani confirma ca la oaie si capra rezultatul fecundităţii este încă foarte variabil, indiferent de condiţiile si mediile de congelare-decongelare utilizate. Cercetările efectuate arata ca, indiferent de diluantul folosit, motilitatea şi integritatea membranară a spermatozoidului se deteriorează pe parcursul răcirii şi stocării la temperaturi joase. Aceste modificări degenerative pot fi rezultatul peroxidării lipidice şi al unei producţii excesive de specii reactive ale oxigenului (ROS). Studiul nostru prezintă rezultatele modificărilor de integritate membranară ale celulelor spermatice de ţap Saanen după congelare-decongelare, in condiţiile diluării spermei de ţap cu mediu pe baza de Tris, îmbogăţit cu 10mM L-cisteină (Sigma), cu 5 mg/ml BSA (Sigma) si cu 1mM vitamina E (DL-a-tocopherol, Merck). După decongelare motilitatea cea mai mare s-a obţinut la variantele cu vitamina E şi cisteină (intre 51-55%). Eşantioane de sperma de ţap diluată cu cei 3 antioxidanţi s-au procesat pentru examen electronomicroscopic şi analizate sub aspectul integrităţii celulare la toate nivelele (cap, porţiunea intermediara, porţiunea principala si porţiunea terminală). Analiza electronomicrofotografiilor efectuate la măriri directe de X10.000, arată că membrane integrale s-au observat într-o proporţie de 49% la celulele diluate cu Tris-vitamina E, la toate nivelele celulei, şi în proporţie de 37% la celulele spermatice diluate cu Tris-cisteina. Membranele balonizate, dar continue s-au considerat a fi normale. In cazul spermei diluata cu mediu suplimentat cu BSA se constata depuneri proteice cu aspect acicular, cu membrane ce prezintă întreruperi mici şi frecvente. Cercetările viitoare îşi propun testarea in vivo a spermei de ţap congelată în medii cu diferite adaosuri de antioxidanţi pentru stabilirea fecundităţii acesteia.
